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細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

更新時(shí)間:2022-01-19  |  點(diǎn)擊率:2656

一、   程序凍存步驟(需梯度降溫)

1、 配置凍存液,凍存液推薦配比:55%(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)+40%(血清)+5%(DMSO)或90%胎牛血清+10%DMSO;推薦使用Procell通用血清型程序凍存液,貨號(hào)PB180436;

2、 制備好的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),計(jì)算總細(xì)胞量;

3、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清,離心轉(zhuǎn)速1200rpm(250g)3min;

4、 加入配置好的凍存液重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL;

5、 分裝入凍存管,一個(gè)凍存管分裝1~1.5毫升;

6、 推薦使用程序降溫盒,分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱過夜;

7、 如沒有程序降溫盒,則按下列順序依次降溫:室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存,注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷,避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化;

8、 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存。

 

注意事項(xiàng):

1、 DMSO配制的時(shí)候會(huì)放熱,一定要等凍存液冷卻后使用,避免灼傷細(xì)胞;

2、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液,減少培養(yǎng)基殘留,避免稀釋凍存液;

3、 不建議手動(dòng)梯度降溫,溫度不穩(wěn)定,容易降低存活率;

4、 注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于最-低刻度線;凍存5次后異丙醇需要更換一次,以免影響凍存效果;程序降溫盒需恢復(fù)到室溫以后才能繼續(xù)使用,不能從冰箱拿出來直接使用;

5、 細(xì)胞懸液加入凍存液以后盡量短時(shí)間的在常溫放置,DMSO常溫下對(duì)細(xì)胞損傷大,分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒放到-80度冰箱,不需要放4度;

6、 -80度凍存過夜后可以轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存,轉(zhuǎn)入液氮的過程需要對(duì)凍存盒進(jìn)行保冷,不要長(zhǎng)時(shí)間在常溫暴露,避免凍存管融化;

7、 若沒有液氮罐,存放在-80度的時(shí)候一定要放靠里面的位置,避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定。

8、 細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,檢測(cè)細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存,為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,再繼續(xù)凍存;

 

二、   非程序凍存步驟(需使用無血清凍存液)

1、  凍存液叢冰箱提前拿出回溫到室溫,推薦Procell無血清非程序凍存液,貨號(hào)PB180438;

2、  制備好的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),計(jì)算總細(xì)胞量;

3、  細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清,離心轉(zhuǎn)速1200rpm(250g)3min;

4、  加入無血清非程序凍存液(PB180438)重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL;

5、  分裝入凍存管,一個(gè)凍存管分裝1~1.5毫升;

6、  分裝好的凍存管直接轉(zhuǎn)入-80度冰箱過夜,不需要程序降溫盒;

7、  轉(zhuǎn)入液氮途中需將凍存管做好保冷措施,避免直接暴露于常溫,快速轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行長(zhǎng)期保存;

 

注意事項(xiàng):

1、 由于沒有使用凍存盒,在轉(zhuǎn)入液氮的過程中一定要對(duì)凍存管做好保冷措施,不能直接用手拿,可以用干冰或者少量液氮保護(hù)后轉(zhuǎn)移,操作過程注意安全;

2、 轉(zhuǎn)移過程要快,避免凍存管暴露于常溫后融化;

3、 若沒有液氮罐,存放在-80度冰箱的時(shí)候一定要放靠里面的位置,避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定;

 

三、   細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1、  將水浴鍋預(yù)熱至37℃,準(zhǔn)備好干凈的一次性PE手套,一個(gè)無菌離心管內(nèi)加入9ml無菌培養(yǎng)基;

2、  將細(xì)胞從液氮罐中取出放入PE手套中,迅速?zèng)]入水浴鍋,搖晃凍存管加速溶解,以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜;

3、  在超凈臺(tái)中將復(fù)蘇好的細(xì)胞液加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi),1200rpm/min 離心3分鐘,離心完畢去掉上清;

4、  用適量與細(xì)胞對(duì)映的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接入到無菌容器中(培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿),補(bǔ)充培養(yǎng)基到適宜,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng);

 

注意事項(xiàng):

1、 水浴鍋的位置如果與液氮罐不是一個(gè)房間,需要對(duì)凍存管進(jìn)行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁,避免路途細(xì)胞表面融化;

2、 細(xì)胞溶解過程快速搖晃以加速溶解;

3、 已溶解的凍存細(xì)胞盡量短時(shí)間的在常溫存放,盡快離心去除DMSO;

4、 貼壁細(xì)胞復(fù)蘇24小時(shí)后觀察,若密度達(dá)到80%,則正常傳代;若密度不到80%則繼續(xù)培養(yǎng)到48小時(shí)再換液;

5、 懸浮細(xì)胞復(fù)蘇3天內(nèi)不建議離心換液;

6、 對(duì)DMSO不敏感的細(xì)胞在復(fù)蘇時(shí)也可不離心,減少操作步驟,也可降低污染的幾率。將解凍的細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi),補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~24h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,移除死細(xì)胞。