凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染,細(xì)胞污染不能*被消除,但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。
本文將簡要介紹幾種常見的細(xì)胞污染類型及處理方法。
特征:大小在0.5~5 μm,比動物細(xì)胞小很多。多呈球狀或桿狀,形態(tài)規(guī)則,分布均勻;增殖速度快,一般污染后48~72小時爆發(fā)式增殖;營養(yǎng)消耗快,培養(yǎng)基很快變黃,變渾濁;鏡下觀察有明顯的定向運動。
處理方法:輕度污染可用10X雙抗清洗處理,重度污染建議消殺后丟棄。
特征:呈鏈球狀或絲狀。常形成肉眼可見的菌落,培養(yǎng)基顏色無變化或變紫,僅對局部細(xì)胞影響較大,其他地方生長正常。會形成孢子,容易污染其他細(xì)胞。
處理方法:真菌污染較難根-除,不建議保留,建議消殺后丟棄。
特征:最小的微生物,無法通過光學(xué)顯微鏡看見,但可通過電鏡觀察到。感染支原體的細(xì)胞,在某一時間點碎片突然增多,隨著傳代,細(xì)胞狀態(tài)顯著變差。支原體污染可通過氣溶膠傳播,影響同一細(xì)胞房其他細(xì)胞。
鑒定方法:PCR法、顯色法、熒光染色法等。
處理方法:若細(xì)胞狀態(tài)尚可,添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰;若細(xì)胞狀態(tài)很差,建議消殺后丟棄。
特征:無明確定義,鏡下無法直接觀察到。主要表現(xiàn)為細(xì)胞狀態(tài)差,黑點和碎片多,布朗運動。通過檢測發(fā)現(xiàn)主要為支原體污染,部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。
處理方式:若細(xì)胞狀態(tài)尚可,添加黑膠蟲/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰;若細(xì)胞狀態(tài)很差,建議消殺后丟棄。
特征:即不同的細(xì)胞混雜在一起
鑒定方法:
同種屬:STR鑒定,多等位基因數(shù)大于3個。
(需考慮本身的遺傳背景,如EA.hy 926為融合細(xì)胞,本身就包含兩套遺傳信息)
不同種屬:PCR法,對種屬特異性基因進(jìn)行擴增,不同種屬產(chǎn)物大小不同。
處理方法:建議重新引種。
細(xì)胞一旦發(fā)現(xiàn)有污染出現(xiàn),應(yīng)及時對所用試劑和耗材進(jìn)行清理。耗材可更換新的或者重新高壓滅菌,試劑可重新過濾除菌或者更換新批次,操作臺和細(xì)胞房需用消毒液進(jìn)行全面清潔消殺后方可復(fù)蘇新的細(xì)胞,以免反復(fù)出現(xiàn)污染。
環(huán)境要求:
潔凈區(qū)10000級,局部100級,定期進(jìn)行沉降菌檢測
環(huán)境消毒:每周一次定期消毒滅菌
1) 地面/墻面:84消毒液、新潔爾滅交叉使用
2) 環(huán)境消毒:定期紫外照射,臭氧熏蒸
3) 儀器設(shè)備表面:75%酒精擦拭
著裝:著連體衣,戴口罩、手套,頭發(fā)、手腕等要包好,減少皮膚外露。
行為:減少走動,出入關(guān)門,操作時不要講話。
技能:養(yǎng)成良好的無菌操作習(xí)慣。
其他:減少共用物品,公共使用區(qū)域統(tǒng)一使用習(xí)慣,區(qū)分潔凈區(qū)域和有風(fēng)險的區(qū)域。
試劑:使用前確保無菌,自己配制的試劑需過濾除菌后再使用。
耗材:需要重復(fù)使用的耗材確保按照規(guī)定清洗、高溫高壓滅菌,使用滅菌指示帶。滅菌后烘干的耗材立刻放進(jìn)超凈臺,一周內(nèi)使用完畢,未使用完的,需重新滅菌再使用。
儀器設(shè)備:定期擦拭消毒,培養(yǎng)箱、顯微鏡托盤等高風(fēng)險區(qū)域需經(jīng)常清潔,培養(yǎng)箱水盤和復(fù)蘇用的水浴鍋需添加抑菌劑。
其他:當(dāng)出現(xiàn)培養(yǎng)物泄漏時,應(yīng)及時清理干凈;出現(xiàn)局部污染時,應(yīng)找出污染源并對環(huán)境整體消毒。