在4月28日開(kāi)播的“常見(jiàn)細(xì)胞污染類型及解決方法"課程中，有很多老師就細(xì)胞污染提出了疑問(wèn)。我們篩選出部分代表性問(wèn)題，并作了詳細(xì)解答。

01

Q：在細(xì)胞培養(yǎng)液中，有種可以游動(dòng)的蟲(chóng)子是什么污染？

A：是細(xì)菌污染。帶鞭毛的細(xì)菌就是會(huì)游動(dòng)的。

02

Q：有很多黑點(diǎn)，在原位顫抖，沒(méi)那么明顯的定向運(yùn)動(dòng)，是什么污染？

A：細(xì)胞碎片、血清沉淀和有些細(xì)菌污染，都會(huì)在原位顫抖。前者是原地做不規(guī)律的布朗運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌是原地轉(zhuǎn)動(dòng)，頻率會(huì)高很多。

03

Q：血清的絮狀物雜質(zhì)屬于正?，F(xiàn)象嗎？

A：血清里面有一些大分子蛋白和一些纖維析出，呈現(xiàn)絮狀，也有一些磷酸鈣析出呈現(xiàn)小黑點(diǎn)，這些都是很常見(jiàn)的。沉淀太多，可以離心去掉部分。血清沉淀的多少也跟血清的溶解方式有關(guān)，溶解過(guò)程中最好是4℃，期間不時(shí)搖晃進(jìn)行溶解。根據(jù)普諾賽多年培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)，血清的沉淀多與少并不決定血清質(zhì)量。

04

Q：液體變微黃、渾濁怎么解決？

A：這個(gè)是典型的細(xì)菌污染。如果細(xì)胞形態(tài)尚且完整，可以嘗試用10%的雙抗清洗去除，或者使用別的抗生素清除，如慶大霉素50U/mL、四環(huán)素10μg/mL等；如果細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)很差，就沒(méi)有挽救的價(jià)值了。

05

Q：為什么有的培養(yǎng)基天天需要換液呢？

A：正常情況下，是不需要每天換液的。培養(yǎng)基橘黃色是細(xì)胞比較喜歡的環(huán)境，正常是2~3天換一次比較好，換液多了細(xì)胞狀態(tài)反而容易受影響。如果是因?yàn)榕囵B(yǎng)基異常消耗，才需要每天換液，那么我們要做的是找到異常消耗的原因，是細(xì)胞量過(guò)多，還是有其他細(xì)菌或者支原體污染。先找到原因才能不用每天換液。

06

Q：我凍存的細(xì)胞，每次復(fù)蘇養(yǎng)幾天就污染了，是什么原因呢？

A：如果凍存前就帶進(jìn)去了污染，那么同一批次的復(fù)蘇出來(lái)都會(huì)有污染。這種情況下，可以在復(fù)蘇當(dāng)天給予抗生素清除（不能用雙抗），如慶大霉素50U/mL、四環(huán)素10μg/mL等；如果同一批有復(fù)蘇沒(méi)有污染的情況，要考慮復(fù)蘇過(guò)程，建議換一下水浴鍋的水和其他試劑耗材再?gòu)?fù)蘇。

07

Q：細(xì)胞培養(yǎng)不生長(zhǎng)，傳代擴(kuò)不起來(lái)，是不是就是支原體污染？

A：支原體污染肉眼是很難區(qū)分的，支原體污染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，但是細(xì)胞狀態(tài)變差并不是都是支原體造成的，所以我們還是要用支原體檢測(cè)加以區(qū)分。

08

Q：培養(yǎng)基污染以后，可以過(guò)濾一下繼續(xù)使用嗎？

A：不建議繼續(xù)使用。培養(yǎng)基里面可能會(huì)有殘留的細(xì)菌分泌物，比如內(nèi)毒素等，可能會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

09

Q：培養(yǎng)箱水盤(pán)用什么抑菌劑？

A：傳統(tǒng)方法用硫酸銅，但是硫酸銅屬于重金屬，還是有一定的毒性的。建議使用水浴鍋安全衛(wèi)士，安全無(wú)毒，可以持續(xù)一周無(wú)菌狀態(tài)。

10

Q：試劑已經(jīng)全部換新的了，還是一直污染，是什么原因？

A：如果試劑盒耗材全部更換了，還需要排除下凍存前是否有污染。再就是是否存在操作問(wèn)題，可考慮換其他人養(yǎng)一下試試。

11

Q：懸浮細(xì)胞碎片形成的黃團(tuán)怎么處理呢？

A：懸浮細(xì)胞碎片形成的黃團(tuán)可以通過(guò)低速離心去除，前提是細(xì)胞量一定要夠多，轉(zhuǎn)速一般可以降低到800rpm左右。離心完上清別急著丟，先看下細(xì)胞是否已經(jīng)離心下來(lái)，也可以根據(jù)細(xì)胞大小調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)速。

12

Q：細(xì)胞里面有一些小方塊一樣的東西，是什么原因？

A：小方塊一般是結(jié)晶類的。可以先用培養(yǎng)基或者PBS稀釋溶解后換液，看有沒(méi)有改善。

13

Q：放了五個(gè)月的*培養(yǎng)基，出現(xiàn)絮狀懸浮物，但是觀察不是細(xì)菌，可以過(guò)濾后加點(diǎn)血清繼續(xù)使用嗎？

A：不建議繼續(xù)使用。絮狀物首先要排除霉菌類的污染；即使排除了霉菌，完培產(chǎn)生絮狀物析出了，也會(huì)對(duì)成分有一定的影響，影響后期培養(yǎng)細(xì)胞。

14

Q：飼養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，如果觀察有沒(méi)有污染，大概要在多大倍鏡下觀看？

A：觀察污染的話400倍鏡就夠了，10X目鏡加40X物鏡。

15

Q：請(qǐng)問(wèn)貼壁細(xì)胞表面有白膜，培養(yǎng)液惡臭，是什么原因?qū)е碌奈廴荆?/strong>

A：有白膜和惡臭應(yīng)該是有污染無(wú)疑了，還很嚴(yán)重，具體是細(xì)菌還是真菌，要結(jié)合顯微鏡下的菌體形態(tài)來(lái)進(jìn)一步區(qū)分。

16

Q：細(xì)胞污染后，用10倍雙抗處理后，沒(méi)有再長(zhǎng)，這時(shí)細(xì)胞可以凍存嗎？

A：細(xì)菌不再生長(zhǎng)，恢復(fù)正常1%抗生素后一周內(nèi)沒(méi)有再長(zhǎng)起來(lái)，就是清除干凈了，可以凍存。

17

Q：孵箱中一瓶細(xì)胞有黑膠蟲(chóng)污染，慢慢地整個(gè)孵箱都有污染了，那孵箱怎么打掃？

A：把細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移走，再用消毒液把培養(yǎng)箱全部擦拭一遍；培養(yǎng)箱水一定要清理干凈；培養(yǎng)箱角落和表面都噴上細(xì)胞房衛(wèi)士，關(guān)閉培養(yǎng)箱保持30分鐘，再打開(kāi)散氣30分鐘，換上干凈的無(wú)菌水就行了。

18

Q：請(qǐng)問(wèn)培養(yǎng)箱滅菌水多久換一次呢？換的時(shí)候每次都要90℃滅菌么？

A：水浴鍋的滅菌水不加抑菌劑的話，建議是每次復(fù)蘇前都更換新的；加了水浴鍋安全衛(wèi)士，可以一周換一次，水是121℃滅菌20分鐘。

19

Q：液氮有沒(méi)有可能污染？

A：理論上液氮這種極-端的環(huán)境里，是不會(huì)有生物存活的，細(xì)菌凍存也是需要保護(hù)劑的。

20

Q：新復(fù)蘇的細(xì)胞，一天后正常貼壁，但是培養(yǎng)液里懸浮大量的黑色團(tuán)塊，是什么原因呢？

A：可能是有細(xì)菌污染了，還是要結(jié)合顯微鏡下的黑團(tuán)形態(tài)來(lái)進(jìn)一步確診。

5月直播課“細(xì)胞傳代增殖問(wèn)題"，將于5月26日開(kāi)播，大家記得關(guān)注哦~